Expressionsprofile verschiedener pKi-67 cDNA-Varianten in Gehirntumoren, Zelllinien und Lymphozyten

Das humane Kernantigen „pKi-67“ ist ein ubiquitäres, streng proliferationassoziiertes Protein, das in allen aktiven Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M) exprimiert wird, nicht jedoch in ruhenden Zellen (G0). Aus diesem Grund werden pKi-67 spezifische monoklonale Antikörper (z.B. MIB-1) routinemäßig zur Bestimmung der Wachstumsfraktion von Tumorzellen eingesetzt. Vom humanen pKi-67 wurden zwei Splicing-Varianten beschrieben (+/- Exon 7), deren Expressionsprofile in verschiedenen Zelltypen untersucht wurde. Methoden: Die Expression der pKi-67 Isoformen wurde in verschiedenen Zelllinien aus Cervix- (HeLa) und Kolon-Karzinomen (CXF94, A549 und SW480), 86 Gewebeproben aus Gehirntumoren (u.a. 30 Oligodendrogliome, 16 Astrozytome, 11 Glioblastome, 11 Meningeome, 3 Medulloblastome, 3 Gliome, 3 Schwannome) sowie an PHA- (Phytohämaggluttinin) stimulierten T-Lymphozyten untersucht. Gesamt-RNA wurde aus unter flüssigem Stickstoff zerkleinertem Gewebe bzw. Pellet isoliert, revers transkribiert und mit pKi-67 spezifischen Primern mittels PCR amplifiziert. Zur Identifizierung von Splicing-Varianten wurden die PCR-Fragmente kloniert und sequenziert. Für die Transfektion verschiedener pKi-67 Domänen wurde ein Tetracyclin-reguliertes Expressionssystem gewählt. Die Zellzyklusverteilung wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Ergebnisse: Neben den beiden bekannten Splicing-Varianten zeigten die Expressionsprofile häufig drei neue Varianten, wovon zwei als alternative Splicingformen identifiziert werden konnten, während die dritte ein verkürztes Exon 7 enthielt. Die Analyse der 93 Gehirntumorgewebeproben ergab Hinweise darauf, dass die beiden als lange (+ Exon 7), bzw. kurze Isoform (- Exon 7) beschriebenen Varianten unabhängig voneinander auftreten können. Anhand PHA-stimulierter, neu in den Zellzyklus eintretender humaner T-Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass die kurze pKi-67 Variante wesentlich früher im einsetzenden Zellzyklus nachweisbar ist als die lange. Durch Transfektion verschiedener pKi-67 Domänen konnte gezeigt werden, dass der N-Terminus der kurzen Isoform die Anzahl von Zellen in der S-Phase erhöhte, während Exon 7 keinen Einfluss auf die Zellzyklusverteilung hatte, aber den Zellzyklus verlangsamte. Diskussion: Die drei zusätzlich entdeckten Splicing-Varianten von pKi-67 waren in verschiedenen Zelllinien und Gewebeproben nachweisbar. Es handelt sich daher höchstwahrscheinlich nicht um Artefakte. Die beiden Hauptisoformen von pKi-67 (+/- Exon 7) können den ermittelten Expressionsprofilen zufolge unabhängig voneinander bzw. in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase exprimiert werden. Die zusammengenommen fünf pKi-67 Isoformen haben möglicherweise eine unterschiedliche Funktion im Zellzyklus