FRNK hemmt Chemotaxis durch verminderte Lamellipodienbildung in Tumorzellen

Einleitung Tumorzellmotilität ist eine wesentliche Voraussetzung zur Extravasation von metastatischen Tumorzellen und Etablierung hämatogener Fernmetastasen. Die Zellmotilität wird durch Lamellipodien und Fokale Adhäsionen an extrazelluläre Matrix vermittelt. Die „Focal Adhesion Kinase“ (FAK) nimmt hierbei eine zentrale Stellung in der intrazelluläre Signaltransduktionskette ein. Wir haben den intrinsischen FAK-Inhibitor FRNK (FAK-related-non-kinase) in einer HCC-Zellinie (HEP G2) überexprimiert, um den Einfluß auf die Zellmotilität und Chemotaxis auf IGF-1 zu untersuchen. Material und Methoden Die FRNK-Sequenz wurde mittels PCR von cDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pCDNA3.1 kloniert. HEP G2 Zellen wurden transient mit dem FRNK-Plasmid (FRNK+) und die Kontrollgruppe mit dem Leer-Plasmid (FRNK-) transfiziert. Chemotaxis auf IGF-I und Zellmotilität wurden im Trans-well-Assay auf Kollagen IV (CIV) bestimmt. In manchen Experimenten erfolgte eine Co-Inkubation nativer Zellen mit Herbimycin, einem spezifischen c-src Inhibitor, um einen weiteren FAK Signalweg zu beeinflussen. Zur morphologischen Beurteilung wurden Immunfluoreszensfärbungen von Zellen nach 10, 30 und 60 Minuten Adhärenz auf CIV durchgeführt. Ergebnisse Die Transfektionrate der Zellen lag bei 50-60% und die Apoptoserate in beiden Gruppen zwischen 5 und 10%. Die FRNK transfizierten Zellen (FRNK+) zeigten dementsprechend eine Reduktion sowohl der Chemotaxis entlang des IGF-1 Gradienten als auch eine Verminderung der Spontanbeweglichkeit um 50-60%. Nach Immunfluoreszenzfärbung mittels eines anti-FAK Antikörpers waren FRNK+ von FRNK- Zellen zuverlässig zu unterscheiden. Nach 10 min Adhärenz auf CIV zeigten die Kontrollzellen ein beginnendes Zellspreading, Lamellipodienbildung und FAKy397 Phosphorylierung. FRNK+ Zellen zeigten nach 10 Minuten Adhärenz keinerlei Zellausläufer und reduzierte FAKy397 Phosphorylierung. Nach 30 und 60 Minuten Adhärenz waren aber auch bei FRNK+ Zellen Filopodien erkennbar. Eine Behandlung der Zellen mit dem c-src Inhibitor Herbimycin (1µM) führte zwar zu einer ähnlich drastischen Reduktion der Zellmotilität, die Ausbildung der Lamellipodien und die Phosphorylierung an FAKy397 war aber in der Frühphase erwartungsgemäß nicht gestört. Diskussion Die Überexpression von FAK führt zu einer verminderten Zellmotilität durch Hemmung der FAKy397 Phosphorylierung. Die verminderte Motilität der Zellen geht auf eine verminderte bzw. aufgehobene Lamellipodienbildung zurück. Die Ausbildung von Filopodien kann dieses Defizit nicht ausgleichen. Lamellipodienbildung und FAKy397 Phosphorylierung werden durch Herbimycin nicht beeinträchtigt. Die verminderte Motilität unter Herbimycinbehandlung ist durch den bei c-src Inhibition reduzierten Turn-over dieser Strukturen erklärbar.