Inhibition der Cyclooxygenase-2-Expression durch Antisense Oligonukleotide

Einleitung: Regelmäßig und über einen längeren Zeitraum eingenommene nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAIDs), welche die Cyclooxygenase-(COX)-Aktivität beider Isoformen, COX-1 und COX-2, hemmen, senken das relative Risiko, z.B. ein Kolon oder ein Mammakarzinom zu entwickeln. Die in verschiedenen Tumorentitäten überexprimierte COX-2 hat eine Bedeutung als pharmakologisches Ziel für die Prophylaxe und Therapie verschiedener menschlicher Tumore. Da ein ausgedehnter Gebrauch von NSAIDs aufgrund der Hemmung von COX-1 zu ungünstigen Nebeneffekten z.B. im Gastrointestinaltrakt führt, ist der Einsatz von selektiven, nur die COX-2-Aktivität bzw.-Synthese hemmenden Wirkstoffen sinnvoll. In unserer Studie sollten spezifisch hemmende COX-2-mRNA-Antisense Oligonukleotide (asODN) entwickelt und ihre Effizienz bei der Hemmung der COX-2-Expression im Zellkulturmodell validiert werden. Methodik: Durch eine computergestützte Sekundärstrukturanalyse der kompletten COX-2-mRNA-Sequenz wurden lokale RNA-Strukturmotive, die die Bindung von komplementären Antisense-Oligonukleotiden begünstigen, vorhergesagt. Es konnten vier verschiedene favorisierte Bereiche der COX-2-mRNA (Position 523, 1487, 2817 und 3823) identifiziert werden, gegen die zehn komplementäre Oligonukleotide entwickelt wurden. Diese und Kontroll-Oligonukleotide ("scrambled") wurden in Vierfachansätzen in einer Konzentration von 200 nM als Phosphothioat-Oligonukleotide in die COX-2-exprimierende Lungenkarzinom-Zelllinie A549 transfiziert. Die RNA-Isolierung für die anschließende quantitative RT-PCR zur Bestimmung der COX-2-mRNA-Kopienzahl erfolgte 24 h nach der Transfektion. Die Ermittlung der relativen COX-2-Proteinexpression erfolgte ebenfalls nach 24 h durchflußzytometrisch unter Einsatz eines anti-COX-2-Antikörpers. Ergebnisse: Die COX-2-mRNA-Kopienzahl war nach Transfektion der Zellen mit zwei der verwendeten asODN (Position 523 und 1487) auf 42 bzw. 59% im Vergleich zu der in nicht behandelten Zellen gesunken. Weitere vier asODN erreichten eine Senkung der Kopienzahl auf etwa 75%, während die übrigen keinen hemmenden Effekt hatten. Die COX-2-Proteinexpression wurde bei Einsatz eines der die mRNA-Kopienzahl auf 75% senkenden asODN (Position 3823) nach 24 h auf 66% gegenüber der in nicht-behandelten Zellen supprimiert. Die übrigen drei bewirkten keine Hemmung der Proteinexpression. Ebenso erzielten auch die beiden auf mRNA-Ebene effizientesten asODN keinen Effekt auf Protein-Ebene (84 bzw. 92% Expression). Diskussion: Die in unserer Studie verwendeten asODN konnten die COX-2-Expression in der Lungenkarzinom-Zelllinie A549 senken. Zur Erhöhung des Hemmeffektes sind zusätzliche Optimierungen erforderlich. Weitere Untersuchungen am Zellkulturmodell sowie am Tiermodell müssen zeigen, ob die beobachtete Hemmung der COX-2 auch einen Einfluß auf Proliferation, Apoptose oder Invasionsfähigkeit der Tumorzellen hat.