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Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie (FACS®, Flourescence Activated Cell Sorting) ist eine Methode, mit der simultan mehrere physikalische Eigenschaften einzelner Partikel mit hoher Durchsatzrate quantifiziert werden k�nnen. F�r die Analyse ist jedes suspendierte Partikel oder jede Zelle von 0,2 � 150 Mikrometer Gr��e f�r die Analyse geeignet.
Die spezifisch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Zellen werden dabei in einer laminaren Str�mung hintereinander einzeln an einem geb�ndelten Laserstrahl geeigneter Wellenl�nge vorbeigeleitet.
Die Eigenschaften, die gemessen werden, sind
- Streulicht
Lichtstreuung tritt immer dann auf, wenn ein Partikel einer L�sung das einfallende Laserlicht ablenkt. Das Ma� dieser Streuung h�ngt von den physikalischen Eigenschaften des Partikels ab, n�mlich von seiner Gr��e und internen Komplexit�t.
- Vorw�rtsstreulicht (Forward Light Scatter, FSC)
- ist proportional zur Zelloberfl�che/-gr��e
- Das FSC entspricht haupts�chlich dem gebeugten Licht und wird entlang der Achse des einfallenden Lichtes mittels einer Photodiode detektiert.
- Seitw�rtsstreulicht (Side Scatter, SSC)
- ist proportional zur internen Komplexit�t (Zellgranularit�t)
- entsteht v.a. aus der Messung des gebrochenen und reflektierten Lichtes, das bei jedem Ber�hrungspunkt in der Zelle durch �nderung des refrakt�ren Index auftritt.
- Die Messung erfolgt etwa im 90� Winkel zum urspr�nglichen Strahl
Zur Verdeutlichung hier eine Vollblut-Probe als Beispiel f�r ein Streulicht-Messergebnis. Zur leichteren Messung der wei�en Blutk�rperchen (Leukozyten) wurden die roten Blutk�rperchen (Erythrozyten) vorher mit einem speziellen Reagenz zerst�rt.
Man erkennt drei gr��ere Populationen:
- Neutrophile Granulozyten: gro�, viel Granula
- Monozyten: gro�, kaum Granula
- Lymphozyten: klein, kaum Granula
- Fluoreszenzsignal
Mit Hilfe der Streulichtparameter kann man einzelne Populationen in einer Probe anhand von Gr��e und Granularit�t identifizieren. Ein Durchflusszytometer kann aber gleichzeitig auch Fluoreszenzlicht messen und erlaubt dadurch, eine Vielzahl von Merkmalen auf den einzelnen Zellen zu untersuchen.
Dabei werden h�ufig monoklonale Antik�rper verwendet, die gegen bestimmte Merkmale auf der Zelloberfl�che gerichtet sind. Durch Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an diese Antik�rper ist dann eine Detektierung des Signals m�glich.
Beispiel 1: Bestimmung der quantitativen Zusammensetzung der Lymphozyten-Population, d.h. wieviel Prozent der Lymphozyten sind T- und wieviel sind B-Lymphozyten?. Dabei kann man als Marker f�r T-Lymphozyten einen CD3-PE-Antik�rper benutzen und f�r B-Lymphozyten einen CD19-FITC-Antik�rper. FITC (Fluorescein-Isothiocyanat, gr�n fluoreszierend) und PE (Phycoerythrin, gelbrot fluoreszierend) sind zwei sehr g�ngige Fluoreszenzfarbstoffe. Eine gleichzeitige Messung mit beiden Fluoreszenzfarbstoffen ist m�glich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenl�nge anregen lassen, aber �ber unterschiedliche (f�r den jeweiligen Farbstoff charakteristische) Emissionspektren verf�gen. Dadurch ist eine schnelle simultane Messung beider Merkmale m�glich.
Beispiel 2: Untersuchung der Membranexpression von Proteinase 3 auf neutrophilen Granulozyten (s.auch �Vaskulitidenforschung�).
In diesem Beispiel ist die Fluoreszenzintensit�t der neutrophilen Granulozyten als H�ufigkeitsverteilung (Histogramm) dargestellt. 82.7% der neutrophilen Granulozyten dieses Patienten sind positiv f�r dieses Oberfl�chenantigen.
Weitere Anwendungen:
- Zellzyklus-Analyse und Apoptoseassays mit Hilfe von RNA/DNA-Farbstoffen
- Bei einigen Durchflusszytometern ist nicht nur das Identifizieren von Zellen mit einem bestimmten Merkmal, sondern auch das anschlie�ende Aussortieren dieser Zellen m�glich
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